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【保存條件】-4℃保存，有效期6個月；-20℃保存，有效期1年?！靖攀觥刻烊荒さ鞍滋崛≡噭┖袨閺母鞣N哺乳動物樣本中分離天然結(jié)構(gòu)膜蛋白而設(shè)計(jì)，使用非變性條件為整體膜和膜相關(guān)蛋白提供3-5倍的富集。易于使用，允許從哺乳動物樣本中快速、穩(wěn)健地兩步提取膜蛋白。為粘附組織培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮生長組織培養(yǎng)細(xì)胞、冷凍細(xì)胞顆粒和組織提供了優(yōu)化的協(xié)議。提供的溫和、非變性條件使膜蛋白處于非變性、功能狀態(tài)，使其特別適合各種特殊的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用和檢測，如酶活性檢測，包括激酶檢測、非變性凝膠電泳、ELISA檢測和整體和膜相關(guān)蛋白質(zhì)的SELDI分析。適用樣本包括：粘附組織培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮生長組織培養(yǎng)細(xì)胞、冷凍細(xì)胞沉淀、組織?！臼褂媒ㄗh】使用前：確保所有緩沖液充分解凍并用渦旋混勻。在提取過程中，Wash Buffer、Extraction Buffer I和II保持在冰上，蛋白酶抑制劑混合液室溫解凍。Extraction Buffer I和II使用前加入相應(yīng)體積蛋白酶抑制劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。20×Wash Buffer稀釋至1×工作液備用：如取1ml加入19ml水混勻稀釋，稀釋后冰上備用。A. 從貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中提取膜蛋白貼壁培養(yǎng)細(xì)胞用于從T25培養(yǎng)瓶（3-5×106細(xì)胞）中提取細(xì)胞單層，作為估計(jì)起始材料數(shù)量的指南，大約從骨肉瘤或肝癌細(xì)胞中提取0.4-2mg的膜蛋白，不同的細(xì)胞可能會產(chǎn)生相當(dāng)不同的蛋白質(zhì)量。 1. 小心地去除培養(yǎng)基，不干擾細(xì)胞。2. 用2ml冰冷1×Wash Buffer小心地加入覆蓋細(xì)胞單層來清洗細(xì)胞。輕輕旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以完全覆蓋細(xì)胞。3. 吸去1×Wash Buffer，注意不要干擾細(xì)胞。4. 重復(fù)步驟3和4一次，以去除培養(yǎng)基中的殘留物。（如果大量細(xì)胞脫落，請將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管，并參考方案B懸浮細(xì)胞的步驟5繼續(xù)操作。）5. 在細(xì)胞容器中加入2ml冰冷Extraction Buffer I（使用前加入蛋白酶抑制劑）。輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使其均勻混合，不擾動細(xì)胞。緩沖液應(yīng)覆蓋所有細(xì)胞。于 4°C下孵育10分鐘，輕微震蕩孵育（若少量細(xì)胞脫落，溫育后將懸液轉(zhuǎn)入離心管并繼續(xù)步驟 7）。6. 棄去上清液（含可溶性蛋白），或用移液器小心轉(zhuǎn)移至樣品管（不擾動細(xì)胞），如需后續(xù)分析請放置冰上保存。7. 在細(xì)胞容器的壁上緩慢加入1ml冰冷Extraction Buffer II（使用前加入蛋白酶抑制劑），同樣方式處理并孵育30分鐘（4°C，輕柔搖晃）。 8. 用移液器將上清（富含整體膜和膜相關(guān)蛋白質(zhì)的部分）轉(zhuǎn)移至新管中，避免擾動細(xì)胞碎片。注意：蛋白質(zhì)提取完若當(dāng)天使用請置于冰上，長期保存建議分裝（如100μl）并保存于?20°C 或?80°C。B. 從懸浮生長組織培養(yǎng)細(xì)胞和冷凍細(xì)胞顆粒中提取膜蛋白 該方案適用于3–5×106懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（相當(dāng)于25–50 mg濕重）。例如，從4 × 106人胚腎細(xì)胞可提取約0.4 mg膜蛋白。不同的細(xì)胞類型可能會產(chǎn)生相當(dāng)不同數(shù)量的蛋白質(zhì)。若準(zhǔn)備凍存細(xì)胞沉淀，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后速凍（參見步驟 1–4），若已凍存好細(xì)胞取出后操作從步驟5開始。1. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，300×g、4°C 離心10分鐘，去除上清。2. 用2 ml冰冷1×Wash Buffer輕柔洗滌細(xì)胞，顛倒混勻使細(xì)胞散開。3. 重復(fù)離心，去除上清。4. 重復(fù)洗滌步驟3–4，最終完全去除1×Wash Buffer。注意：此處可速凍細(xì)胞沉淀保存至?70°C以下。5. 在離心管中加入2ml冰冷Extraction Buffer I（使用前加入蛋白酶抑制劑），輕輕吹打以徹底重懸細(xì)胞，4°C搖晃孵育10分鐘。6. 以16,000×g、4°C離心15分鐘。7. 棄上清（含可溶性蛋白）或轉(zhuǎn)移保留。8. 加入1 ml冰冷Extraction Buffer II（使用前加入蛋白酶抑制劑），徹底重懸細(xì)胞，4°C 輕柔振蕩孵育30分鐘。9. 再次以16,000×g、4°C離心15分鐘。10. 用移液器轉(zhuǎn)移上清（膜蛋白部分），避免擾動沉淀。C. 從組織中提取膜蛋白該方法適用于25–50mg新鮮或速凍組織。例如35 mg牛肝可提取約2 mg膜蛋白。不同的組織類型可能會產(chǎn)生相當(dāng)不同數(shù)量的蛋白質(zhì)。組織預(yù)處理： 解剖后迅速去除非目標(biāo)組織（如結(jié)締組織、脂肪、血管），將組織切成約2mm3，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后可立即速凍（步驟 1–4），若已凍存好細(xì)胞取出后操作從步驟5開始。1. 切除非目標(biāo)組織，組織切片后置入含2 ml冰冷Wash Buffer 的管中。2. 輕輕顛倒混勻，去除血細(xì)胞和松散雜質(zhì)。3. 100×g、4°C離心2分鐘，棄上清。4. 重復(fù)洗滌步驟3–4，最終完全去除1×Wash Buffer。注意：此處可速凍組織沉淀保存至?70°C以下。5. 將組織（或已凍存組織）置入預(yù)冷勻漿器，加入2 ml冰冷Extraction Buffer I（使用前加入蛋白酶抑制劑）。6. 低溫勻漿（例如牛肝約需10次研磨，不同設(shè)備和樣本有偏差），直至不見組織塊。避免過度碎裂至細(xì)胞完全碎裂。7. 將勻漿轉(zhuǎn)移至預(yù)冷離心管，4°C輕柔搖晃孵育10分鐘。8. 以16,000×g、4°C 離心15分鐘。9. 棄去上清（可溶性蛋白），或保留備用。10. 加入1 ml冰冷Extraction Buffer II（使用前加入蛋白酶抑制劑），徹底重懸組織沉淀，孵育30分鐘。11. 再次以16,000×g、4°C 離心15分鐘。12. 轉(zhuǎn)移上清（膜蛋白部分）至新離心管中，避免擾動沉淀?！咀⒁馐马?xiàng)】1. 高溫可能破壞膜蛋白及GPCR結(jié)構(gòu)，尤其是結(jié)合脂類的受體可能發(fā)生聚集或失活，導(dǎo)致信號弱或smear。煮樣時需采用溫和條件：加完上樣緩沖液后50°C 30分鐘處理，不要加熱至90-100°C。若膜蛋白有多次跨膜情況如GPCR可選擇EK-6020 ProEx G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）提取和穩(wěn)定試劑盒。2. 本產(chǎn)品長時間低溫存放可能會出現(xiàn)沉淀，可在37oC水浴約10分鐘以充分溶解沉淀。沉淀完全溶解后即可正常使用。3. 為保證最佳的使用效果，請盡量避免過多的反復(fù)凍融，可分裝后使用。4. 裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。

【保存條件】-4℃保存，有效期6個月；-20℃保存，有效期1年?！靖攀觥刻烊荒さ鞍滋崛≡噭┖袨閺母鞣N哺乳動物樣本中分離天然結(jié)構(gòu)膜蛋白而設(shè)計(jì)，使用非變性條件為整體膜和膜相關(guān)蛋白提供3-5倍的富集。易于使用，允許從哺乳動物樣本中快速、穩(wěn)健地兩步提取膜蛋白。為粘附組織培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮生長組織培養(yǎng)細(xì)胞、冷凍細(xì)胞顆粒和組織提供了優(yōu)化的協(xié)議。提供的溫和、非變性條件使膜蛋白處于非變性、功能狀態(tài)，使其特別適合各種特殊的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用和檢測，如酶活性檢測，包括激酶檢測、非變性凝膠電泳、ELISA檢測和整體和膜相關(guān)蛋白質(zhì)的SELDI分析。適用樣本包括：粘附組織培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮生長組織培養(yǎng)細(xì)胞、冷凍細(xì)胞沉淀、組織。【使用建議】使用前：確保所有緩沖液充分解凍并用渦旋混勻。在提取過程中，Wash Buffer、Extraction Buffer I和II保持在冰上，蛋白酶抑制劑混合液室溫解凍。Extraction Buffer I和II使用前加入相應(yīng)體積蛋白酶抑制劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。20×Wash Buffer稀釋至1×工作液備用：如取1ml加入19ml水混勻稀釋，稀釋后冰上備用。A. 從貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中提取膜蛋白貼壁培養(yǎng)細(xì)胞用于從T25培養(yǎng)瓶（3-5×106細(xì)胞）中提取細(xì)胞單層，作為估計(jì)起始材料數(shù)量的指南，大約從骨肉瘤或肝癌細(xì)胞中提取0.4-2mg的膜蛋白，不同的細(xì)胞可能會產(chǎn)生相當(dāng)不同的蛋白質(zhì)量。 1. 小心地去除培養(yǎng)基，不干擾細(xì)胞。2. 用2ml冰冷1×Wash Buffer小心地加入覆蓋細(xì)胞單層來清洗細(xì)胞。輕輕旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以完全覆蓋細(xì)胞。3. 吸去1×Wash Buffer，注意不要干擾細(xì)胞。4. 重復(fù)步驟3和4一次，以去除培養(yǎng)基中的殘留物。（如果大量細(xì)胞脫落，請將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管，并參考方案B懸浮細(xì)胞的步驟5繼續(xù)操作。）5. 在細(xì)胞容器中加入2ml冰冷Extraction Buffer I（使用前加入蛋白酶抑制劑）。輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使其均勻混合，不擾動細(xì)胞。緩沖液應(yīng)覆蓋所有細(xì)胞。于 4°C下孵育10分鐘，輕微震蕩孵育（若少量細(xì)胞脫落，溫育后將懸液轉(zhuǎn)入離心管并繼續(xù)步驟 7）。6. 棄去上清液（含可溶性蛋白），或用移液器小心轉(zhuǎn)移至樣品管（不擾動細(xì)胞），如需后續(xù)分析請放置冰上保存。7. 在細(xì)胞容器的壁上緩慢加入1ml冰冷Extraction Buffer II（使用前加入蛋白酶抑制劑），同樣方式處理并孵育30分鐘（4°C，輕柔搖晃）。 8. 用移液器將上清（富含整體膜和膜相關(guān)蛋白質(zhì)的部分）轉(zhuǎn)移至新管中，避免擾動細(xì)胞碎片。注意：蛋白質(zhì)提取完若當(dāng)天使用請置于冰上，長期保存建議分裝（如100μl）并保存于?20°C 或?80°C。B. 從懸浮生長組織培養(yǎng)細(xì)胞和冷凍細(xì)胞顆粒中提取膜蛋白 該方案適用于3–5×106懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（相當(dāng)于25–50 mg濕重）。例如，從4 × 106人胚腎細(xì)胞可提取約0.4 mg膜蛋白。不同的細(xì)胞類型可能會產(chǎn)生相當(dāng)不同數(shù)量的蛋白質(zhì)。若準(zhǔn)備凍存細(xì)胞沉淀，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后速凍（參見步驟 1–4），若已凍存好細(xì)胞取出后操作從步驟5開始。1. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，300×g、4°C 離心10分鐘，去除上清。2. 用2 ml冰冷1×Wash Buffer輕柔洗滌細(xì)胞，顛倒混勻使細(xì)胞散開。3. 重復(fù)離心，去除上清。4. 重復(fù)洗滌步驟3–4，最終完全去除1×Wash Buffer。注意：此處可速凍細(xì)胞沉淀保存至?70°C以下。5. 在離心管中加入2ml冰冷Extraction Buffer I（使用前加入蛋白酶抑制劑），輕輕吹打以徹底重懸細(xì)胞，4°C搖晃孵育10分鐘。6. 以16,000×g、4°C離心15分鐘。7. 棄上清（含可溶性蛋白）或轉(zhuǎn)移保留。8. 加入1 ml冰冷Extraction Buffer II（使用前加入蛋白酶抑制劑），徹底重懸細(xì)胞，4°C 輕柔振蕩孵育30分鐘。9. 再次以16,000×g、4°C離心15分鐘。10. 用移液器轉(zhuǎn)移上清（膜蛋白部分），避免擾動沉淀。C. 從組織中提取膜蛋白該方法適用于25–50mg新鮮或速凍組織。例如35 mg牛肝可提取約2 mg膜蛋白。不同的組織類型可能會產(chǎn)生相當(dāng)不同數(shù)量的蛋白質(zhì)。組織預(yù)處理： 解剖后迅速去除非目標(biāo)組織（如結(jié)締組織、脂肪、血管），將組織切成約2mm3，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后可立即速凍（步驟 1–4），若已凍存好細(xì)胞取出后操作從步驟5開始。1. 切除非目標(biāo)組織，組織切片后置入含2 ml冰冷Wash Buffer 的管中。2. 輕輕顛倒混勻，去除血細(xì)胞和松散雜質(zhì)。3. 100×g、4°C離心2分鐘，棄上清。4. 重復(fù)洗滌步驟3–4，最終完全去除1×Wash Buffer。注意：此處可速凍組織沉淀保存至?70°C以下。5. 將組織（或已凍存組織）置入預(yù)冷勻漿器，加入2 ml冰冷Extraction Buffer I（使用前加入蛋白酶抑制劑）。6. 低溫勻漿（例如牛肝約需10次研磨，不同設(shè)備和樣本有偏差），直至不見組織塊。避免過度碎裂至細(xì)胞完全碎裂。7. 將勻漿轉(zhuǎn)移至預(yù)冷離心管，4°C輕柔搖晃孵育10分鐘。8. 以16,000×g、4°C 離心15分鐘。9. 棄去上清（可溶性蛋白），或保留備用。10. 加入1 ml冰冷Extraction Buffer II（使用前加入蛋白酶抑制劑），徹底重懸組織沉淀，孵育30分鐘。11. 再次以16,000×g、4°C 離心15分鐘。12. 轉(zhuǎn)移上清（膜蛋白部分）至新離心管中，避免擾動沉淀?！咀⒁馐马?xiàng)】1. 高溫可能破壞膜蛋白及GPCR結(jié)構(gòu)，尤其是結(jié)合脂類的受體可能發(fā)生聚集或失活，導(dǎo)致信號弱或smear。煮樣時需采用溫和條件：加完上樣緩沖液后50°C 30分鐘處理，不要加熱至90-100°C。若膜蛋白有多次跨膜情況如GPCR可選擇EK-6020 ProEx G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）提取和穩(wěn)定試劑盒。2. 本產(chǎn)品長時間低溫存放可能會出現(xiàn)沉淀，可在37oC水浴約10分鐘以充分溶解沉淀。沉淀完全溶解后即可正常使用。3. 為保證最佳的使用效果，請盡量避免過多的反復(fù)凍融，可分裝后使用。4. 裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。

【保存條件】 -20℃避光保存，有效期1年。 【概述】 Hoechst 33342是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對細(xì)胞的毒性較低。Hoechst 33342染色常用于細(xì)胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測。Hoechst 33342也常用于普通的細(xì)胞核染色，或常規(guī)的DNA染色。 Hoechst 33342的最大激發(fā)波長為346nm，最大發(fā)射波長為460nm；Hoechst 33342和雙鏈DNA結(jié)合后，最大激發(fā)波長為 350nm，最大發(fā)射波長為461nm。 本Hoechst 33342染色液可直接用于固定細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色，也可直接用于活細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色。 【使用方法】 該產(chǎn)品使用時應(yīng)室溫解凍并充分搖勻。 1. 對于固定的細(xì)胞或組織： a. 對于細(xì)胞或組織樣品，固定后，適當(dāng)洗滌去除固定劑。隨后如果需要進(jìn)行免疫熒光染色，則先進(jìn)行免疫熒光染色，染色完畢后再按后續(xù)步驟進(jìn)行Hoechst 33342染色。如果不需要進(jìn)行其它染色，則直接進(jìn)行后續(xù)的Hoechst 33342染色。 b. 對于貼壁細(xì)胞或組織切片，加入少量Hoechst 33342染色液，覆蓋住樣品即可。對于懸浮細(xì)胞，至少加入待染色樣品體積3倍的染色液，混勻。室溫放置3-5分鐘。 c. 吸除Hoechst 33342染色液，用PBS或生理鹽水洗滌2-3次，每次3-5分鐘。 d. 直接在熒光顯微鏡下觀察或封片后熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，會看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。 2. 對于活細(xì)胞或培養(yǎng)的組織： a. 加入適當(dāng)量Hoechst 33342染色液，必須充分覆蓋住待染色的樣品，通常對于6孔板一個孔需加入1ml染色液，對于96孔板一個孔需加入100微升染色液。 b. 在適宜于細(xì)胞培養(yǎng)的溫度培養(yǎng)20-30分鐘。棄染色液，用PBS或培養(yǎng)液洗滌2-3次即可進(jìn)行熒光檢測。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，在熒光顯微鏡下觀察會看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。 【注意事項(xiàng)】 1. 本品為進(jìn)口原料配制，成像與穩(wěn)定效果更佳。 2. 熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡量當(dāng)天完成檢測。 3. 為減緩熒光淬滅可以使用ES-8312抗熒光淬滅封片劑。 4. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 【參考文獻(xiàn)】 1. Targeting a therapeutic LIF transgene to muscle via the immune system ameliorates muscular dystrophy. Steven S Welc et al. Nature communications, 10(1), 2788-2788 (2019) 2. The transforming activity of Wnt effectors correlates with their ability to induce the accumulation of mammary progenitor cells. Liu BY, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 101, 4158-4163 (2004)

【保存條件】-20℃避光保存，有效期1年。【概述】Hoechst 33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對細(xì)胞的毒性較低。Hoechst 33258染色常用于細(xì)胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測。Hoechst 33258也常用于普通的細(xì)胞核染色，或常規(guī)的DNA染色。Hoechst 33258的最大激發(fā)波長為346nm，最大發(fā)射波長為460nm；Hoechst 33258和雙鏈DNA結(jié)合后，最大激發(fā)波長為352nm，最大發(fā)射波長為461nm。本品Hoechst 33258染色液可直接用于固定細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色，也可直接用于活細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色?！臼褂梅椒ā吭摦a(chǎn)品使用時應(yīng)室溫解凍并充分搖勻。1. 對于固定的細(xì)胞或組織：a. 對于細(xì)胞或組織樣品，固定后，適當(dāng)洗滌去除固定劑。隨后如果需要進(jìn)行免疫熒光染色，則先進(jìn)行免疫熒光染色，染色完畢后再按后續(xù)步驟進(jìn)行Hoechst 33258染色。如果不需要進(jìn)行其它染色，則直接進(jìn)行后續(xù)的Hoechst 33258染色。b. 對于貼壁細(xì)胞或組織切片，加入少量Hoechst 33258染色液，覆蓋住樣品即可。對于懸浮細(xì)胞，至少加入待染色樣品體積3倍的染色液，混勻。室溫放置3-5分鐘。c. 吸除Hoechst 33258染色液，用PBS或生理鹽水洗滌2-3次，每次3-5分鐘。d. 直接在熒光顯微鏡下觀察或封片后熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，會看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。2. 對于活細(xì)胞或培養(yǎng)的組織：a. 加入適當(dāng)量Hoechst 33258染色液，必須充分覆蓋住待染色的樣品，通常對于6孔板一個孔需加入1ml 染色液，對于96孔板一個孔需加入100微升染色液。b. 在適宜于細(xì)胞培養(yǎng)的溫度培養(yǎng)20-30分鐘。棄染色液，用PBS或培養(yǎng)液洗滌2-3次即可進(jìn)行熒光檢測。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，在熒光顯微鏡下觀察會看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染?！咀⒁馐马?xiàng)】1. 本品為進(jìn)口原料配制，成像與穩(wěn)定效果更佳。2. Hoechst 33258對人體有害，請注意適當(dāng)防護(hù)。3. 熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡量當(dāng)天完成檢測。4. 為減緩熒光淬滅可以使用ES-8312抗熒光淬滅封片劑。5. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

【保存條件】-20℃避光保存，有效期1年?！靖攀觥縃oechst 33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對細(xì)胞的毒性較低。Hoechst 33258染色常用于細(xì)胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測。Hoechst 33258也常用于普通的細(xì)胞核染色，或常規(guī)的DNA染色。Hoechst 33258的最大激發(fā)波長為346nm，最大發(fā)射波長為460nm；Hoechst 33258和雙鏈DNA結(jié)合后，最大激發(fā)波長為352nm，最大發(fā)射波長為461nm。本品Hoechst 33258染色液可直接用于固定細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色，也可直接用于活細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色。【使用方法】該產(chǎn)品使用時應(yīng)室溫解凍并充分搖勻。1. 對于固定的細(xì)胞或組織：a. 對于細(xì)胞或組織樣品，固定后，適當(dāng)洗滌去除固定劑。隨后如果需要進(jìn)行免疫熒光染色，則先進(jìn)行免疫熒光染色，染色完畢后再按后續(xù)步驟進(jìn)行Hoechst 33258染色。如果不需要進(jìn)行其它染色，則直接進(jìn)行后續(xù)的Hoechst 33258染色。b. 對于貼壁細(xì)胞或組織切片，加入少量Hoechst 33258染色液，覆蓋住樣品即可。對于懸浮細(xì)胞，至少加入待染色樣品體積3倍的染色液，混勻。室溫放置3-5分鐘。c. 吸除Hoechst 33258染色液，用PBS或生理鹽水洗滌2-3次，每次3-5分鐘。d. 直接在熒光顯微鏡下觀察或封片后熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，會看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。2. 對于活細(xì)胞或培養(yǎng)的組織：a. 加入適當(dāng)量Hoechst 33258染色液，必須充分覆蓋住待染色的樣品，通常對于6孔板一個孔需加入1ml 染色液，對于96孔板一個孔需加入100微升染色液。b. 在適宜于細(xì)胞培養(yǎng)的溫度培養(yǎng)20-30分鐘。棄染色液，用PBS或培養(yǎng)液洗滌2-3次即可進(jìn)行熒光檢測。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，在熒光顯微鏡下觀察會看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染?！咀⒁馐马?xiàng)】1. 本品為進(jìn)口原料配制，成像與穩(wěn)定效果更佳。2. Hoechst 33258對人體有害，請注意適當(dāng)防護(hù)。3. 熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡量當(dāng)天完成檢測。4. 為減緩熒光淬滅可以使用ES-8312抗熒光淬滅封片劑。5. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

【保存條件】GPCR蛋白提取及穩(wěn)定劑保存于2-8℃；蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物-20℃保存一年【產(chǎn)品概述】提取后穩(wěn)定受體的天然和功能形式面臨諸多挑戰(zhàn)，這使得細(xì)胞膜外研究極其困難。本提取試劑可在 1-2 小時內(nèi)高效地從哺乳動物細(xì)胞或組織中提取功能性受體。大多數(shù)功能性 GPCR 檢測必須在受體提取后立即進(jìn)行，因?yàn)槭荏w活性會隨著時間的推移迅速下降。本品主要用于從培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞或組織中提取和穩(wěn)定G偶聯(lián)蛋白受體 (GPCR) 及其他膜相關(guān)蛋白。該提取試劑將受體封裝在經(jīng)過專門優(yōu)化的去垢劑膠束中，以確保提取后受體在 4°C 下儲存時可保持長達(dá)1周的功能，在 -20°C下儲存時可保持長達(dá)1個月的功能。本品每1ml可用于1×106個細(xì)胞或50-100 mg組織的GPCR及各類膜蛋白的提取。【操作方法】使用前：GPCR提取及穩(wěn)定劑根據(jù)用量提前加入蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物，每1ml GPCR蛋白提取及穩(wěn)定試劑中加入20ul 蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物，現(xiàn)配現(xiàn)用。A: 對于貼壁細(xì)胞：1. 在培養(yǎng)板上用10-15 mL預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞兩次。2. 加入1 mL預(yù)冷PBS，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞從板表面刮掉（或胰酶消化收集細(xì)胞，消化后記得及時終止消化）。3. 將 1×106個細(xì)胞重懸于1 mL預(yù)冷的PBS中。收集細(xì)胞懸液，4°C，500 × g 離心5分鐘。4. 小心吸出并棄去上清液。用1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。4°C 下500 × g離心5分鐘，棄去上清液。5. 將1 mL預(yù)冷的GPCR提取及穩(wěn)定劑（含抑制劑）加入細(xì)胞沉淀中。用移液器上下吹打10-15次充分混勻，然后短暫渦旋以獲得均勻的細(xì)胞懸液。在 4°C下持續(xù)旋轉(zhuǎn)或振蕩孵育30分鐘充分裂解。注意：對于過度表達(dá)系統(tǒng)，在此步驟需要進(jìn)行輕度機(jī)械破壞以獲得最佳效果（如對于 Expi293 系統(tǒng)，使用 Dounce 均質(zhì)機(jī)或手持式組織研磨機(jī)進(jìn)行均質(zhì)化可增加活性受體的產(chǎn)量）。6. 將管子在 4°C下以 16,000×g的速度離心20分鐘。小心地吸取含有穩(wěn)定蛋白受體的上清液，并將其轉(zhuǎn)移到新的離心管中。7. 立即進(jìn)行下游應(yīng)用或?qū)⑻崛∥锏确衷嚇觾Υ嬖?°C下保存長達(dá)1周或在-20°C下保存長達(dá) 1個月以備將來使用，同時最大程度地減少受體功能的損失。注意：對于懸浮細(xì)胞GPCR提取，以 500×g離心5分鐘收獲1×106個細(xì)胞。用10-15 mL冷PBS清洗收獲的細(xì)胞沉淀物兩次，并在 4°C下以500×g離心5分鐘。小心吸出并棄去上清液。用1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。4°C，500 × g 離心 5 分鐘，棄去上清液。后進(jìn)行步驟5及后續(xù)步驟。B: 對于組織樣本：1. 將50-100 mg 組織置于5 mL離心管中。加入4 mL預(yù)冷PBS，短暫渦旋，棄去洗液。2. 轉(zhuǎn)移至 2 mL Dounce勻漿器中，用剪刀將組織剪成小塊。加入1 mL預(yù)冷GPCR 提取和穩(wěn)定劑（含抑制劑），勻漿至均勻懸浮（10-15 次）。注意：使用手動組織研磨機(jī)進(jìn)行均質(zhì)化是可以的，但留意可能會導(dǎo)致起泡，勿使用超聲破碎。3. 將勻漿轉(zhuǎn)移到新管中，在 4°C下持續(xù)旋轉(zhuǎn)或振蕩孵育30分鐘充分裂解。4. 將管子在 4°C下以 16,000×g的速度離心20分鐘。小心地吸取含有穩(wěn)定蛋白受體的上清液，并將其轉(zhuǎn)移到新的離心管中。5. 立即進(jìn)行下游應(yīng)用或?qū)⑻崛∥锏确衷嚇觾Υ嬖?4°C 下保存長達(dá) 1 周或在 -20°C 下保存長達(dá) 1 個月以備將來使用，同時最大程度地減少受體功能的損失?！咀⒁馐马?xiàng)】1. 高溫可能破壞膜蛋白及GPCR結(jié)構(gòu)，尤其是結(jié)合脂類的受體可能發(fā)生聚集或失活，導(dǎo)致信號弱或smear。煮樣時需采用溫和條件：加完上樣緩沖液后50°C 30分鐘處理，不要加熱至90-100°C。2. 多數(shù)膜蛋白試劑不能很好用于GPCR的提取，本產(chǎn)品可同時用于GPCR和各類膜蛋白的提取。如加上樣緩沖液膜蛋白無法溶解后出現(xiàn)沉淀，可適當(dāng)超聲再加樣（若無則不需要）。3. 該產(chǎn)品僅實(shí)驗(yàn)室使用，不適合農(nóng)業(yè)/家庭/臨床用途使用。

【保存條件】GPCR蛋白提取及穩(wěn)定劑保存于2-8℃；蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物-20℃保存一年【產(chǎn)品概述】提取后穩(wěn)定受體的天然和功能形式面臨諸多挑戰(zhàn)，這使得細(xì)胞膜外研究極其困難。本提取試劑可在 1-2 小時內(nèi)高效地從哺乳動物細(xì)胞或組織中提取功能性受體。大多數(shù)功能性 GPCR 檢測必須在受體提取后立即進(jìn)行，因?yàn)槭荏w活性會隨著時間的推移迅速下降。本品主要用于從培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞或組織中提取和穩(wěn)定G偶聯(lián)蛋白受體 (GPCR) 及其他膜相關(guān)蛋白。該提取試劑將受體封裝在經(jīng)過專門優(yōu)化的去垢劑膠束中，以確保提取后受體在 4°C 下儲存時可保持長達(dá)1周的功能，在 -20°C下儲存時可保持長達(dá)1個月的功能。本品每1ml可用于1×106個細(xì)胞或50-100 mg組織的GPCR及各類膜蛋白的提取。【操作方法】使用前：GPCR提取及穩(wěn)定劑根據(jù)用量提前加入蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物，每1ml GPCR蛋白提取及穩(wěn)定試劑中加入20ul 蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物，現(xiàn)配現(xiàn)用。A: 對于貼壁細(xì)胞：1. 在培養(yǎng)板上用10-15 mL預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞兩次。2. 加入1 mL預(yù)冷PBS，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞從板表面刮掉（或胰酶消化收集細(xì)胞，消化后記得及時終止消化）。3. 將 1×106個細(xì)胞重懸于1 mL預(yù)冷的PBS中。收集細(xì)胞懸液，4°C，500 × g 離心5分鐘。4. 小心吸出并棄去上清液。用1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。4°C 下500 × g離心5分鐘，棄去上清液。5. 將1 mL預(yù)冷的GPCR提取及穩(wěn)定劑（含抑制劑）加入細(xì)胞沉淀中。用移液器上下吹打10-15次充分混勻，然后短暫渦旋以獲得均勻的細(xì)胞懸液。在 4°C下持續(xù)旋轉(zhuǎn)或振蕩孵育30分鐘充分裂解。注意：對于過度表達(dá)系統(tǒng)，在此步驟需要進(jìn)行輕度機(jī)械破壞以獲得最佳效果（如對于 Expi293 系統(tǒng)，使用 Dounce 均質(zhì)機(jī)或手持式組織研磨機(jī)進(jìn)行均質(zhì)化可增加活性受體的產(chǎn)量）。6. 將管子在 4°C下以 16,000×g的速度離心20分鐘。小心地吸取含有穩(wěn)定蛋白受體的上清液，并將其轉(zhuǎn)移到新的離心管中。7. 立即進(jìn)行下游應(yīng)用或?qū)⑻崛∥锏确衷嚇觾Υ嬖?°C下保存長達(dá)1周或在-20°C下保存長達(dá) 1個月以備將來使用，同時最大程度地減少受體功能的損失。注意：對于懸浮細(xì)胞GPCR提取，以 500×g離心5分鐘收獲1×106個細(xì)胞。用10-15 mL冷PBS清洗收獲的細(xì)胞沉淀物兩次，并在 4°C下以500×g離心5分鐘。小心吸出并棄去上清液。用1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。4°C，500 × g 離心 5 分鐘，棄去上清液。后進(jìn)行步驟5及后續(xù)步驟。B: 對于組織樣本：1. 將50-100 mg 組織置于5 mL離心管中。加入4 mL預(yù)冷PBS，短暫渦旋，棄去洗液。2. 轉(zhuǎn)移至 2 mL Dounce勻漿器中，用剪刀將組織剪成小塊。加入1 mL預(yù)冷GPCR 提取和穩(wěn)定劑（含抑制劑），勻漿至均勻懸浮（10-15 次）。注意：使用手動組織研磨機(jī)進(jìn)行均質(zhì)化是可以的，但留意可能會導(dǎo)致起泡，勿使用超聲破碎。3. 將勻漿轉(zhuǎn)移到新管中，在 4°C下持續(xù)旋轉(zhuǎn)或振蕩孵育30分鐘充分裂解。4. 將管子在 4°C下以 16,000×g的速度離心20分鐘。小心地吸取含有穩(wěn)定蛋白受體的上清液，并將其轉(zhuǎn)移到新的離心管中。5. 立即進(jìn)行下游應(yīng)用或?qū)⑻崛∥锏确衷嚇觾Υ嬖?4°C 下保存長達(dá) 1 周或在 -20°C 下保存長達(dá) 1 個月以備將來使用，同時最大程度地減少受體功能的損失。【注意事項(xiàng)】1. 高溫可能破壞膜蛋白及GPCR結(jié)構(gòu)，尤其是結(jié)合脂類的受體可能發(fā)生聚集或失活，導(dǎo)致信號弱或smear。煮樣時需采用溫和條件：加完上樣緩沖液后50°C 30分鐘處理，不要加熱至90-100°C。2. 多數(shù)膜蛋白試劑不能很好用于GPCR的提取，本產(chǎn)品可同時用于GPCR和各類膜蛋白的提取。如加上樣緩沖液膜蛋白無法溶解后出現(xiàn)沉淀，可適當(dāng)超聲再加樣（若無則不需要）。3. 該產(chǎn)品僅實(shí)驗(yàn)室使用，不適合農(nóng)業(yè)/家庭/臨床用途使用。

【保存條件】-4℃保存，有效期6個月；-20℃保存，有效期1年?！靖攀觥勘酒诽峁┝艘环N比較簡單、方便地從 培養(yǎng)細(xì)胞或組織中抽提細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞漿蛋白的方法。抽提的膜蛋白不僅包括質(zhì)膜上的膜蛋白，也包括線粒體膜、內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)膜和高爾基體膜等上的膜蛋白。本品從各種哺乳動物樣本中分離天然結(jié)構(gòu)膜蛋白而設(shè)計(jì)，使用非變性條件為整體膜和膜相關(guān)蛋白提供3-5倍的富集。本品提供的溫和、非變性條件使膜蛋白處于非變性、功能狀態(tài)，使其特別適合各種特殊的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用和檢測，如酶活性檢測，包括激酶檢測、非變性凝膠電泳、Western Blot檢測、ELISA檢測和整體和膜相關(guān)蛋白質(zhì)的SELDI分析。適用樣本包括：粘附組織培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮生長組織培養(yǎng)細(xì)胞、冷凍細(xì)胞沉淀、組織。【使用建議】使用前：確保所有緩沖液充分解凍并用渦旋混勻。在提取過程中，Wash Buffer、高純細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑A和高純細(xì)胞膜蛋白提取試劑B保持在冰上，蛋白酶抑制劑混合液室溫解凍。細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑A和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑B使用前加入相應(yīng)體積蛋白酶抑制劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。20×Wash Buffer稀釋至1×工作液備用：如取1ml加入19ml水混勻稀釋，稀釋后冰上備用。I. 從細(xì)胞中提取細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜蛋白該方案適用于5–10×106懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（相當(dāng)于50–80 mg濕重）。A: 對于貼壁細(xì)胞：用預(yù)冷的PBS洗一遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，或用EDTA溶液(0.03%)處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。取2ml離心管收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。（注：盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。）B: 對于懸浮細(xì)胞：先離心收集細(xì)胞，再用預(yù)冷的PBS清洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。1. 在離心管中加入2ml冰冷高純細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑A（使用前加入蛋白酶抑制劑），輕輕吹打以徹底重懸細(xì)胞，4°C搖晃孵育10分鐘。2. 以16,000×g、4°C離心15分鐘。3. 用移液器轉(zhuǎn)移上清（細(xì)胞質(zhì)蛋白）轉(zhuǎn)移至新的離心管中或凍-80℃?zhèn)溆?，注意不要擾動沉淀。4. 往沉淀中加入1 ml冰冷高純細(xì)胞膜蛋白提取試劑B（使用前加入蛋白酶抑制劑），徹底重懸吹打均勻，4°C 輕柔振蕩孵育30分鐘。5. 再次以16,000×g、4°C離心15分鐘。6. 轉(zhuǎn)移上清（細(xì)胞膜蛋白）至新的離心管中或凍-80℃?zhèn)溆茫⒁獠灰獢_動沉淀。II. 從組織中提取細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜蛋白該方法適用于50–80mg新鮮或速凍組織。組織預(yù)處理： 解剖后迅速去除非目標(biāo)組織（如結(jié)締組織、脂肪、血管），將組織切成約2mm3，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后可立即速凍（步驟1–4），若已凍存好組織取出后操作從步驟5開始。1. 切除非目標(biāo)組織，組織切片后置入含2 ml冰冷1×Wash Buffer 的管中。2. 輕輕顛倒混勻，去除血細(xì)胞和松散雜質(zhì)。3. 100×g、4°C離心2分鐘，棄上清。4. 重復(fù)洗滌步驟3–4，最終完全去除1×Wash Buffer。注意：此處可速凍組織沉淀保存至?70°C以下。5. 將組織（或已凍存組織）置入預(yù)冷勻漿器，加入2 ml冰冷高純細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑A（使用前加入蛋白酶抑制劑）。6. 低溫勻漿（不同設(shè)備和樣本勻漿次數(shù)有偏差），直至不見組織塊。避免過度碎裂至細(xì)胞完全碎裂。細(xì)胞或組織樣品的破碎及破碎效果的鑒定:把細(xì)胞懸液或組織樣品轉(zhuǎn)移到一適當(dāng)大小的冰浴預(yù)冷玻璃勻漿器中，勻漿約30-50次，勻漿效果與細(xì)胞類型和組織類型相關(guān)，不同細(xì)胞或組織所需的勻漿次數(shù)有所不同，需自行優(yōu)化。通?？梢栽趧驖{30次后取約2-3微升細(xì)胞或組織勻漿液滴在蓋玻片上并在顯微鏡下觀察，如見細(xì)胞核周暈環(huán)或完整的細(xì)胞形態(tài)，說明細(xì)胞仍完整。如果有70-80%的細(xì)胞均無核周暈環(huán)和完整細(xì)胞形態(tài)，說明細(xì)胞已經(jīng)充分破碎，則進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。否則，重新勻漿10-30次直到細(xì)胞至少70%已經(jīng)破碎。同時記錄對于該細(xì)胞的勻漿次數(shù)，通常在后續(xù)實(shí)驗(yàn)時不必再摸索勻漿次數(shù)。另外需注意特定的勻漿次數(shù)和勻漿器也有關(guān)，需同時注意記錄使用的是哪一個勻漿器。 7. 將勻漿轉(zhuǎn)移至預(yù)冷離心管，4°C輕柔搖晃孵育10分鐘。8. 以16,000×g、4°C 離心15分鐘。9. 用移液器轉(zhuǎn)移上清（細(xì)胞質(zhì)蛋白）轉(zhuǎn)移至新的離心管中或凍-80℃?zhèn)溆茫⒁獠灰獢_動沉淀。10. 加入1 ml冰冷高純細(xì)胞膜蛋白提取試劑B（使用前加入蛋白酶抑制劑），徹底重懸組織沉淀，孵育30分鐘。11. 再次以16,000×g、4°C離心15分鐘。12. 轉(zhuǎn)移上清（細(xì)胞膜蛋白）至新的離心管中或凍-80℃?zhèn)溆茫⒁獠灰獢_動沉淀?！咀⒁馐马?xiàng)】1. 為了您的安全與健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。2. 若膜蛋白有多次跨膜情況如GPCR可選擇EK-6020 ProEx G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）提取和穩(wěn)定試劑盒。3. 為保證最佳的使用效果，請盡量避免過多的反復(fù)凍融，可分裝后使用。4. 裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。5. 該試劑僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

【保存條件】 -4℃保存，有效期6個月；-20℃保存，有效期1年。 【概述】 本品提供了一種比較簡單、方便地從 培養(yǎng)細(xì)胞或組織中抽提細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞漿蛋白的方法。抽提的膜蛋白不僅包括質(zhì)膜上的膜蛋白，也包括線粒體膜、內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)膜和高爾基體膜等上的膜蛋白。本品從各種哺乳動物樣本中分離天然結(jié)構(gòu)膜蛋白而設(shè)計(jì)，使用非變性條件為整體膜和膜相關(guān)蛋白提供3-5倍的富集。 本品提供的溫和、非變性條件使膜蛋白處于非變性、功能狀態(tài)，使其特別適合各種特殊的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用和檢測，如酶活性檢測，包括激酶檢測、非變性凝膠電泳、Western Blot檢測、ELISA檢測和整體和膜相關(guān)蛋白質(zhì)的SELDI分析。適用樣本包括：粘附組織培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮生長組織培養(yǎng)細(xì)胞、冷凍細(xì)胞沉淀、組織。 【使用建議】 使用前：確保所有緩沖液充分解凍并用渦旋混勻。在提取過程中，Wash Buffer、高純細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑A和高純細(xì)胞膜蛋白提取試劑B保持在冰上，蛋白酶抑制劑混合液室溫解凍。細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑A和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑B使用前加入相應(yīng)體積蛋白酶抑制劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。 20×Wash Buffer稀釋至1×工作液備用：如取1ml加入19ml水混勻稀釋，稀釋后冰上備用。 I. 從細(xì)胞中提取細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜蛋白 該方案適用于5–10×106懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（相當(dāng)于50–80 mg濕重）。 A: 對于貼壁細(xì)胞：用預(yù)冷的PBS洗一遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，或用EDTA溶液(0.03%)處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。取2ml離心管收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。（注：盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。） B: 對于懸浮細(xì)胞：先離心收集細(xì)胞，再用預(yù)冷的PBS清洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。 1. 在離心管中加入2ml冰冷高純細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑A（使用前加入蛋白酶抑制劑），輕輕吹打以徹底重懸細(xì)胞，4°C搖晃孵育10分鐘。 2. 以16,000×g、4°C離心15分鐘。 3. 用移液器轉(zhuǎn)移上清（細(xì)胞質(zhì)蛋白）轉(zhuǎn)移至新的離心管中或凍-80℃?zhèn)溆茫⒁獠灰獢_動沉淀。 4. 往沉淀中加入1 ml冰冷高純細(xì)胞膜蛋白提取試劑B（使用前加入蛋白酶抑制劑），徹底重懸吹打均勻，4°C 輕柔振蕩孵育30分鐘。 5. 再次以16,000×g、4°C離心15分鐘。 6. 轉(zhuǎn)移上清（細(xì)胞膜蛋白）至新的離心管中或凍-80℃?zhèn)溆?，注意不要擾動沉淀。 II. 從組織中提取細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜蛋白 該方法適用于50–80mg新鮮或速凍組織。 組織預(yù)處理： 解剖后迅速去除非目標(biāo)組織（如結(jié)締組織、脂肪、血管），將組織切成約2mm3，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后可立即速凍（步驟1–4），若已凍存好組織取出后操作從步驟5開始。 1. 切除非目標(biāo)組織，組織切片后置入含2 ml冰冷1×Wash Buffer 的管中。 2. 輕輕顛倒混勻，去除血細(xì)胞和松散雜質(zhì)。 3. 100×g、4°C離心2分鐘，棄上清。 4. 重復(fù)洗滌步驟3–4，最終完全去除1×Wash Buffer。 注意：此處可速凍組織沉淀保存至?70°C以下。 5. 將組織（或已凍存組織）置入預(yù)冷勻漿器，加入2 ml冰冷高純細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑A（使用前加入蛋白酶抑制劑）。 6. 低溫勻漿（不同設(shè)備和樣本勻漿次數(shù)有偏差），直至不見組織塊。避免過度碎裂至細(xì)胞完全碎裂。 細(xì)胞或組織樣品的破碎及破碎效果的鑒定:把細(xì)胞懸液或組織樣品轉(zhuǎn)移到一適當(dāng)大小的冰浴預(yù)冷玻璃勻漿器中，勻漿約30-50次，勻漿效果與細(xì)胞類型和組織類型相關(guān)，不同細(xì)胞或組織所需的勻漿次數(shù)有所不同，需自行優(yōu)化。 通?？梢栽趧驖{30次后取約2-3微升細(xì)胞或組織勻漿液滴在蓋玻片上并在顯微鏡下觀察，如見細(xì)胞核周暈環(huán)或完整的細(xì)胞形態(tài)，說明細(xì)胞仍完整。如果有70-80%的細(xì)胞均無核周暈環(huán)和完整細(xì)胞形態(tài)，說明細(xì)胞已經(jīng)充分破碎，則進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。否則，重新勻漿10-30次直到細(xì)胞至少70%已經(jīng)破碎。同時記錄對于該細(xì)胞的勻漿次數(shù)，通常在后續(xù)實(shí)驗(yàn)時不必再摸索勻漿次數(shù)。另外需注意特定的勻漿次數(shù)和勻漿器也有關(guān)，需同時注意記錄使用的是哪一個勻漿器。 7. 將勻漿轉(zhuǎn)移至預(yù)冷離心管，4°C輕柔搖晃孵育10分鐘。 8. 以16,000×g、4°C 離心15分鐘。 9. 用移液器轉(zhuǎn)移上清（細(xì)胞質(zhì)蛋白）轉(zhuǎn)移至新的離心管中或凍-80℃?zhèn)溆?，注意不要擾動沉淀。 10. 加入1 ml冰冷高純細(xì)胞膜蛋白提取試劑B（使用前加入蛋白酶抑制劑），徹底重懸組織沉淀，孵育30分鐘。 11. 再次以16,000×g、4°C離心15分鐘。 12. 轉(zhuǎn)移上清（細(xì)胞膜蛋白）至新的離心管中或凍-80℃?zhèn)溆?，注意不要擾動沉淀。 【注意事項(xiàng)】 1. 為了您的安全與健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 2. 若膜蛋白有多次跨膜情況如GPCR可選擇EK-6020 ProEx G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）提取和穩(wěn)定試劑盒。 3. 為保證最佳的使用效果，請盡量避免過多的反復(fù)凍融，可分裝后使用。 4. 裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。 5. 該試劑僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

【保存條件】-20℃保存一年【操作方法】A: 對于貼壁細(xì)胞：用 PBS 洗一遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，或用 EDTA 溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。（注：盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。）B: 對于懸浮細(xì)胞：用預(yù)冷的 PBS 清洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。C: 對于組織：建議先用將組織剪成小塊，然后使用勻漿器加入預(yù)冷緩沖液 C 勻漿（冰上處理）。注意：手動方法可能適用于某些軟組織，例如大腦。1. 從組織/細(xì)胞中提取各組分蛋白①使用前在 Buffer C、N、M 中加入蛋白酶抑制劑(磷酸化研究則需同時添加磷酸酶抑制劑，現(xiàn)配現(xiàn)用)。②收集細(xì)胞，建議數(shù)量量 5-10×10 6個細(xì)胞，加入 240μl 移液預(yù)冷緩沖液 C（含抑制劑）。如有必要，可以增加使用更多緩沖液 C。不建議降低使用量，因?yàn)槿绻芤鹤兊锰恚@將影響細(xì)胞成分的分離。組織量最小不小于 40mg（每 g組織加入約 2ml 預(yù)冷緩沖液 C），太小的組織蛋白提取出來后濃度過低。③通過渦旋使細(xì)胞充分分散，持續(xù) 20 秒或至細(xì)胞完全分散。若細(xì)胞貼壁過緊無法渦旋分散則用移液器吹打至均勻，組織則加入緩沖液 C 后低溫勻漿至完全均質(zhì)化。④在 4°C 下孵育混合物 10 分鐘（震蕩孵育有助于更好裂解）。⑤將混合物在 4°C 下以最高轉(zhuǎn)速或 13,000 g 轉(zhuǎn)速下離心 10 分鐘。吸出上清液并將其保存到另一個干凈離心管中，上清液即為細(xì)胞質(zhì)蛋白。沉淀包含膜、細(xì)胞核部分，放在冰上繼續(xù)后續(xù)操作。離心轉(zhuǎn)速越高越利于分離，離心時間亦可延長至 20 分鐘。⑥加入 300μl 預(yù)冷緩沖液 C（無需蛋白酶抑制劑等）洗滌并重懸沉淀。每克組織加入 1.5ml 預(yù)冷緩沖液 C 清洗。⑦在 4°C 下孵育混合物 5 分鐘（震蕩孵育有助于更好清洗）。本步驟主要目的是清洗，低溫下有利于蛋白穩(wěn)定。⑧在 4°C 下再次以最高轉(zhuǎn)速或 13,000 g 轉(zhuǎn)速下離心 10 分鐘。小心地倒掉上清液并丟棄，必要時用紙巾擦拭管子的邊緣。該洗滌步驟僅有助于減少與細(xì)胞質(zhì)蛋白的交叉污染，如果需要，可以重復(fù)多一次該步驟以減少交叉污染。⑨向沉淀中加入 100μl 預(yù)冷緩沖液 N，并從上一步驟中重懸沉淀。⑩在 4°C 下孵育混合物 10 分鐘（震蕩孵育有助于更好裂解）。11.在 4°C 下以最高轉(zhuǎn)速或 13,000 g 轉(zhuǎn)速下離心 10 分鐘。取出上清液并將其保存到另一個離心管中，核蛋白位于該上清液中。剩余含膜蛋白沉淀離心管放在冰上，繼續(xù)下游操作。12. 用每克組織 300μl 預(yù)冷緩沖液 C（無需蛋白酶抑制劑等）洗滌并重懸沉淀。本步驟主要目的是清洗，低溫下有利于蛋白穩(wěn)定。13. 在 4°C 下再次以最高轉(zhuǎn)速或 13,000 g 轉(zhuǎn)速下離心 10 分鐘。小心地倒掉上清液并丟棄，必要時用紙巾擦拭管子的邊緣。該洗滌步驟僅有助于減少與細(xì)胞核蛋白的交叉污染，如果需要，可以重復(fù)多一次該步驟以減少交叉污染。14. 向沉淀中加入每克組織 100μl 預(yù)冷緩沖液 M 并重懸。15. 在 4°C 下?lián)u床震蕩輕輕混合混合物 20 分鐘（可增加超聲 10 秒促溶解）。建議增加超聲過程有助于膜蛋白的溶解，10 秒每次，可多次超聲。16. 在 4°C 下以最高轉(zhuǎn)速或 13,000 g 離心 10 分鐘。取出上清液并將其保存到另一個離心管中，膜蛋白位于該上清液中?！咀⒁馐马?xiàng)】1. 該產(chǎn)品僅實(shí)驗(yàn)室使用，不適合農(nóng)業(yè)/家庭/臨床用途使用。2. 為了您的安全與健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。