ECOTOP貨號:ES-6225售價:¥338.00
EasyLys-I 昆蟲活性蛋白提取試劑
【保存條件】 4℃保存,一年有效。室溫保存,至少2周內有效。-20℃可以保存更長時間。 【概述】 本產品能夠快速、溫和、有效地抽提昆蟲細胞或組織的總蛋白,抽提的蛋白能較好地保持其原有的空間結構和生物學活性,可用于多種生物化學和細胞生物學用途。例如,帶有His、GST、HA、Flag、Myc、V5等標簽蛋白的分離純化,免疫印跡(Western blot)、免疫沉淀(Immunoprecipitation)、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)和ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)等常規生化分析,luciferase、β-gal、alkaline phosphatase、chloramphenicol acetyltransferase (CAT)等報告基因(Report gene)酶活性檢測,PKA、PKC和酪氨酸激酶(tyrosine kinase)等蛋白激酶活力的檢測等方面的用途。 【操作方法】 1. 溶液的準備 取適量的昆蟲活性蛋白抽提試劑,根據具體實驗目的加入適量的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑,也可以根據實驗目的選不含磷酸酶抑制劑的蛋白酶抑制劑混合物。放置于冰浴備用。 2. 懸浮培養昆蟲細胞的蛋白抽提 a. 收集細胞:對細胞進行計數,并確定總的細胞數。800g室溫離心5min,棄上清。 b. 洗滌細胞(可選做):用PBS洗滌細胞,800g室溫離心5min,棄上清。如有必要,可以再重復洗滌一次。 c. 裂解細胞:彈擊離心管底,使細胞沉淀適當分散開。每0.5-2×107個細胞加入冰浴預冷的1ml 昆蟲活性蛋白抽提試劑,用移液器吹打混勻,再以中速渦懸震蕩約5秒后置于冰上孵育10min。如果希望獲得更多的蛋白,或者對于一些較難裂解提取的蛋白,則需要額外的孵育時間以提高得率。額外的孵育時間,可能會增加蛋白得率。 d. 12,000-16,000g (16,000g更佳) 4℃離心15min。 e. 將含有可溶性蛋白的上清轉移到新的離心管中,立即用于后續分析檢測,或者-20℃或-80℃保存備用。如有必要,可以考慮保留沉淀物用于后續分析。 3. 貼壁培養昆蟲細胞的蛋白抽提 a. 洗滌細胞(可選做):吸除培養液,加入適量PBS,輕輕搖動,吸除PBS重復洗滌一次。如有必要,可以再重復洗滌一次。 洗滌過程中應盡量避免貼壁細胞的脫落,如果發生細胞脫落,可以收集相應的培養液或PBS溶液,800g離心5min,以沉淀并收集脫落的細胞。 b. 裂解細胞:吸凈細胞培養液或洗滌液,參考下表,加入適量的昆蟲活性蛋白抽提試劑,冰上孵育10min。冰上孵育期間,可以將培養器皿放置在水平或側擺搖床上劇烈搖動、敲擊細胞培養瓶細胞培養側的外壁或用細胞刮刮下貼壁細胞。通常直接孵育5-6min后,昆蟲細胞會逐漸出現從培養器皿表面脫落的現象。 培養板/皿 表面積(cm2) 裂解液用量(μl) 10-cm dish 55 500-1000 6-cm dish 21 200-400 6孔板 9.5 100-200 12孔板 3.8 50-100 24孔板 1.9 25-50 48孔板 0.95 12.5-25 96孔板 0.32 5-10 c. 用移液器將細胞抽提產物吹打懸起并轉移到離心管中,12,000-16,000g (16,000g更佳) 4℃離心15min。 d. 將含有可溶性蛋白的上清轉移到新的離心管中,立即用于后續分析檢測,或者-20℃或-80℃保存備用。如有必要,可以考慮保留沉淀物用于后續分析。吸取上清時觸及沉淀會導致抽提產物中含有更多的雜蛋白等 【注意事項】 1. 該產品僅實驗室使用,不適合農業/家庭/臨床用途使用。 2. 為了您的安全與健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。






