ECOTOP貨號：EK-6005-100T(貨期：現貨)售價：￥799.00
細胞膜/細胞質/細胞核蛋白提取試劑盒
【保存條件】-20℃保存一年【操作方法】A: 對于貼壁細胞：用 PBS 洗一遍，用細胞刮子刮下細胞，或用 EDTA 溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細胞。離心收集細胞，盡最大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。（注：盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。）B: 對于懸浮細胞：用預冷的 PBS 清洗一遍，離心收集細胞，盡最大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。C: 對于組織：建議先用將組織剪成小塊，然后使用勻漿器加入預冷緩沖液 C 勻漿（冰上處理）。注意：手動方法可能適用于某些軟組織，例如大腦。1. 從組織/細胞中提取各組分蛋白①使用前在 Buffer C、N、M 中加入蛋白酶抑制劑(磷酸化研究則需同時添加磷酸酶抑制劑，現配現用)。②收集細胞，建議數量量 5-10×10 6個細胞，加入 240μl 移液預冷緩沖液 C（含抑制劑）。如有必要，可以增加使用更多緩沖液 C。不建議降低使用量，因為如果溶液變得太稠，這將影響細胞成分的分離。組織量最小不小于 40mg（每 g組織加入約 2ml 預冷緩沖液 C），太小的組織蛋白提取出來后濃度過低。③通過渦旋使細胞充分分散，持續 20 秒或至細胞完全分散。若細胞貼壁過緊無法渦旋分散則用移液器吹打至均勻，組織則加入緩沖液 C 后低溫勻漿至完全均質化。④在 4°C 下孵育混合物 10 分鐘（震蕩孵育有助于更好裂解）。⑤將混合物在 4°C 下以最高轉速或 13,000 g 轉速下離心 10 分鐘。吸出上清液并將其保存到另一個干凈離心管中，上清液即為細胞質蛋白。沉淀包含膜、細胞核部分，放在冰上繼續后續操作。離心轉速越高越利于分離，離心時間亦可延長至 20 分鐘。⑥加入 300μl 預冷緩沖液 C（無需蛋白酶抑制劑等）洗滌并重懸沉淀。每克組織加入 1.5ml 預冷緩沖液 C 清洗。⑦在 4°C 下孵育混合物 5 分鐘（震蕩孵育有助于更好清洗）。本步驟主要目的是清洗，低溫下有利于蛋白穩定。⑧在 4°C 下再次以最高轉速或 13,000 g 轉速下離心 10 分鐘。小心地倒掉上清液并丟棄，必要時用紙巾擦拭管子的邊緣。該洗滌步驟僅有助于減少與細胞質蛋白的交叉污染，如果需要，可以重復多一次該步驟以減少交叉污染。⑨向沉淀中加入 100μl 預冷緩沖液 N，并從上一步驟中重懸沉淀。⑩在 4°C 下孵育混合物 10 分鐘（震蕩孵育有助于更好裂解）。11.在 4°C 下以最高轉速或 13,000 g 轉速下離心 10 分鐘。取出上清液并將其保存到另一個離心管中，核蛋白位于該上清液中。剩余含膜蛋白沉淀離心管放在冰上，繼續下游操作。12. 用每克組織 300μl 預冷緩沖液 C（無需蛋白酶抑制劑等）洗滌并重懸沉淀。本步驟主要目的是清洗，低溫下有利于蛋白穩定。13. 在 4°C 下再次以最高轉速或 13,000 g 轉速下離心 10 分鐘。小心地倒掉上清液并丟棄，必要時用紙巾擦拭管子的邊緣。該洗滌步驟僅有助于減少與細胞核蛋白的交叉污染，如果需要，可以重復多一次該步驟以減少交叉污染。14. 向沉淀中加入每克組織 100μl 預冷緩沖液 M 并重懸。15. 在 4°C 下搖床震蕩輕輕混合混合物 20 分鐘（可增加超聲 10 秒促溶解）。建議增加超聲過程有助于膜蛋白的溶解，10 秒每次，可多次超聲。16. 在 4°C 下以最高轉速或 13,000 g 離心 10 分鐘。取出上清液并將其保存到另一個離心管中，膜蛋白位于該上清液中。【注意事項】1. 該產品僅實驗室使用，不適合農業/家庭/臨床用途使用。2. 為了您的安全與健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
