【保存條件】

GPCR蛋白提取及穩定劑保存于2-8℃；蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物-20℃保存一年

【產品概述】

提取后穩定受體的天然和功能形式面臨諸多挑戰，這使得細胞膜外研究極其困難。本提取試劑可在 1-2 小時內高效地從哺乳動物細胞或組織中提取功能性受體。大多數功能性 GPCR 檢測必須在受體提取后立即進行，因為受體活性會隨著時間的推移迅速下降。

本品主要用于從培養的哺乳動物細胞或組織中提取和穩定G偶聯蛋白受體 (GPCR) 及其他膜相關蛋白。該提取試劑將受體封裝在經過專門優化的去垢劑膠束中，以確保提取后受體在 4°C 下儲存時可保持長達1周的功能，在 -20°C下儲存時可保持長達1個月的功能。

本品每1ml可用于1×10⁶個細胞或50-100 mg組織的GPCR及各類膜蛋白的提取。

【操作方法】

使用前：GPCR提取及穩定劑根據用量提前加入蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物，每1ml GPCR蛋白提取及穩定試劑中加入20ul 蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物，現配現用。

A: 對于貼壁細胞：

1. 在培養板上用10-15 mL預冷PBS清洗細胞兩次。

2. 加入1 mL預冷PBS，用細胞刮刀將細胞從板表面刮掉（或胰酶消化收集細胞，消化后記得及時終止消化）。

3. 將 1×10⁶個細胞重懸于1 mL預冷的PBS中。收集細胞懸液，4°C，500 × g 離心5分鐘。

4. 小心吸出并棄去上清液。用1 mL預冷的PBS重懸細胞，并轉移至1.5 mL離心管中。4°C 下500 × g離心5分鐘，棄去上清液。

5. 將1 mL預冷的GPCR提取及穩定劑（含抑制劑）加入細胞沉淀中。用移液器上下吹打10-15次充分混勻，然后短暫渦旋以獲得均勻的細胞懸液。在 4°C下持續旋轉或振蕩孵育30分鐘充分裂解。

注意：對于過度表達系統，在此步驟需要進行輕度機械破壞以獲得最佳效果（如對于 Expi293 系統，使用 Dounce 均質機或手持式組織研磨機進行均質化可增加活性受體的產量）。

6. 將管子在 4°C下以 16,000×g的速度離心20分鐘。小心地吸取含有穩定蛋白受體的上清液，并將其轉移到新的離心管中。

7. 立即進行下游應用或將提取物等分試樣儲存在4°C下保存長達1周或在-20°C下保存長達 1個月以備將來使用，同時最大程度地減少受體功能的損失。

注意：對于懸浮細胞GPCR提取，以 500×g離心5分鐘收獲1×10⁶個細胞。用10-15 mL冷PBS清洗收獲的細胞沉淀物兩次，并在 4°C下以500×g離心5分鐘。小心吸出并棄去上清液。用1 mL預冷的PBS重懸細胞，并轉移至1.5 mL離心管中。4°C，500 × g 離心 5 分鐘，棄去上清液。后進行步驟5及后續步驟。

B: 對于組織樣本：

1. 將50-100 mg 組織置于5 mL離心管中。加入4 mL預冷PBS，短暫渦旋，棄去洗液。

2. 轉移至 2 mL Dounce勻漿器中，用剪刀將組織剪成小塊。加入1 mL預冷GPCR 提取和穩定劑（含抑制劑），勻漿至均勻懸浮（10-15 次）。

注意：使用手動組織研磨機進行均質化是可以的，但留意可能會導致起泡，勿使用超聲破碎。

3. 將勻漿轉移到新管中，在 4°C下持續旋轉或振蕩孵育30分鐘充分裂解。

4. 將管子在 4°C下以 16,000×g的速度離心20分鐘。小心地吸取含有穩定蛋白受體的上清液，并將其轉移到新的離心管中。

5. 立即進行下游應用或將提取物等分試樣儲存在 4°C 下保存長達 1 周或在 -20°C 下保存長達 1 個月以備將來使用，同時最大程度地減少受體功能的損失。

【注意事項】

1. 高溫可能破壞膜蛋白及GPCR結構，尤其是結合脂類的受體可能發生聚集或失活，導致信號弱或smear。煮樣時需采用溫和條件：加完上樣緩沖液后50°C 30分鐘處理，不要加熱至90-100°C。

2. 多數膜蛋白試劑不能很好用于GPCR的提取，本產品可同時用于GPCR和各類膜蛋白的提取。如加上樣緩沖液膜蛋白無法溶解后出現沉淀，可適當超聲再加樣（若無則不需要）。

3. 該產品僅實驗室使用，不適合農業/家庭/臨床用途使用。