【保存條件】
-4℃保存，有效期6個月；-20℃保存，有效期1年。
【概述】
天然膜蛋白提取試劑盒為從各種哺乳動物樣本中分離天然結(jié)構(gòu)膜蛋白而設(shè)計，使用非變性條件為整體膜和膜相關(guān)蛋白提供3-5倍的富集。易于使用，允許從哺乳動物樣本中快速、穩(wěn)健地兩步提取膜蛋白。為粘附組織培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮生長組織培養(yǎng)細(xì)胞、冷凍細(xì)胞顆粒和組織提供了優(yōu)化的協(xié)議。提供的溫和、非變性條件使膜蛋白處于非變性、功能狀態(tài)，使其特別適合各種特殊的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用和檢測，如酶活性檢測，包括激酶檢測、非變性凝膠電泳、ELISA檢測和整體和膜相關(guān)蛋白質(zhì)的SELDI分析。適用樣本包括：粘附組織培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮生長組織培養(yǎng)細(xì)胞、冷凍細(xì)胞沉淀、組織。
【使用建議】
使用前：確保所有緩沖液充分解凍并用渦旋混勻。在提取過程中，Wash Buffer、Extraction Buffer I和II保持在冰上，蛋白酶抑制劑混合液室溫解凍。Extraction Buffer I和II使用前加入相應(yīng)體積蛋白酶抑制劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。20×Wash Buffer稀釋至1×工作液備用：如取1ml加入19ml水混勻稀釋，稀釋后冰上備用。
A. 從貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中提取膜蛋白
貼壁培養(yǎng)細(xì)胞用于從T25培養(yǎng)瓶（3-5×106細(xì)胞）中提取細(xì)胞單層，作為估計起始材料數(shù)量的指南，大約從骨肉瘤或肝癌細(xì)胞中提取0.4-2mg的膜蛋白，不同的細(xì)胞可能會產(chǎn)生相當(dāng)不同的蛋白質(zhì)量。
1. 小心地去除培養(yǎng)基，不干擾細(xì)胞。
2. 用2ml冰冷1×Wash Buffer小心地加入覆蓋細(xì)胞單層來清洗細(xì)胞。輕輕旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以完全覆蓋細(xì)胞。
3. 吸去1×Wash Buffer，注意不要干擾細(xì)胞。
4. 重復(fù)步驟3和4一次，以去除培養(yǎng)基中的殘留物。（如果大量細(xì)胞脫落，請將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管，并參考方案B懸浮細(xì)胞的步驟5繼續(xù)操作。）
5. 在細(xì)胞容器中加入2ml冰冷Extraction Buffer I（使用前加入蛋白酶抑制劑）。輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使其均勻混合，不擾動細(xì)胞。緩沖液應(yīng)覆蓋所有細(xì)胞。于 4°C下孵育10分鐘，輕微震蕩孵育（若少量細(xì)胞脫落，溫育后將懸液轉(zhuǎn)入離心管并繼續(xù)步驟 7）。
6. 棄去上清液（含可溶性蛋白），或用移液器小心轉(zhuǎn)移至樣品管（不擾動細(xì)胞），如需后續(xù)分析請放置冰上保存。
7. 在細(xì)胞容器的壁上緩慢加入1ml冰冷Extraction Buffer II（使用前加入蛋白酶抑制劑），同樣方式處理并孵育30分鐘（4°C，輕柔搖晃）。
8. 用移液器將上清（富含整體膜和膜相關(guān)蛋白質(zhì)的部分）轉(zhuǎn)移至新管中，避免擾動細(xì)胞碎片。
注意：蛋白質(zhì)提取完若當(dāng)天使用請置于冰上，長期保存建議分裝（如100μl）并保存于?20°C 或?80°C。
B. 從懸浮生長組織培養(yǎng)細(xì)胞和冷凍細(xì)胞顆粒中提取膜蛋白
該方案適用于3–5×106懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（相當(dāng)于25–50 mg濕重）。例如，從4 × 106人胚腎細(xì)胞可提取約0.4 mg膜蛋白。不同的細(xì)胞類型可能會產(chǎn)生相當(dāng)不同數(shù)量的蛋白質(zhì)。
若準(zhǔn)備凍存細(xì)胞沉淀，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后速凍（參見步驟 1–4），若已凍存好細(xì)胞取出后操作從步驟5開始。
1. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，300×g、4°C 離心10分鐘，去除上清。
2. 用2 ml冰冷1×Wash Buffer輕柔洗滌細(xì)胞，顛倒混勻使細(xì)胞散開。
3. 重復(fù)離心，去除上清。
4. 重復(fù)洗滌步驟3–4，最終完全去除1×Wash Buffer。
注意：此處可速凍細(xì)胞沉淀保存至?70°C以下。
5. 在離心管中加入2ml冰冷Extraction Buffer I（使用前加入蛋白酶抑制劑），輕輕吹打以徹底重懸細(xì)胞，4°C搖晃孵育10分鐘。
6. 以16,000×g、4°C離心15分鐘。
7. 棄上清（含可溶性蛋白）或轉(zhuǎn)移保留。
8. 加入1 ml冰冷Extraction Buffer II（使用前加入蛋白酶抑制劑），徹底重懸細(xì)胞，4°C 輕柔振蕩孵育30分鐘。
9. 再次以16,000×g、4°C離心15分鐘。
10. 用移液器轉(zhuǎn)移上清（膜蛋白部分），避免擾動沉淀。
C. 從組織中提取膜蛋白
該方法適用于25–50mg新鮮或速凍組織。例如35 mg牛肝可提取約2 mg膜蛋白。不同的組織類型可能會產(chǎn)生相當(dāng)不同數(shù)量的蛋白質(zhì)。
組織預(yù)處理： 解剖后迅速去除非目標(biāo)組織（如結(jié)締組織、脂肪、血管），將組織切成約2mm3，使用1×Wash Buffer或1×PBS清洗后可立即速凍（步驟 1–4），若已凍存好細(xì)胞取出后操作從步驟5開始。
1. 切除非目標(biāo)組織，組織切片后置入含2 ml冰冷Wash Buffer 的管中。
2. 輕輕顛倒混勻，去除血細(xì)胞和松散雜質(zhì)。
3. 100×g、4°C離心2分鐘，棄上清。
4. 重復(fù)洗滌步驟3–4，最終完全去除1×Wash Buffer。
注意：此處可速凍組織沉淀保存至?70°C以下。
5. 將組織（或已凍存組織）置入預(yù)冷勻漿器，加入2 ml冰冷Extraction Buffer I（使用前加入蛋白酶抑制劑）。
6. 低溫勻漿（例如牛肝約需10次研磨，不同設(shè)備和樣本有偏差），直至不見組織塊。避免過度碎裂至細(xì)胞完全碎裂。
7. 將勻漿轉(zhuǎn)移至預(yù)冷離心管，4°C輕柔搖晃孵育10分鐘。
8. 以16,000×g、4°C 離心15分鐘。
9. 棄去上清（可溶性蛋白），或保留備用。
10. 加入1 ml冰冷Extraction Buffer II（使用前加入蛋白酶抑制劑），徹底重懸組織沉淀，孵育30分鐘。
11. 再次以16,000×g、4°C 離心15分鐘。
12. 轉(zhuǎn)移上清（膜蛋白部分）至新離心管中，避免擾動沉淀。
【注意事項】
1. 高溫可能破壞膜蛋白及GPCR結(jié)構(gòu)，尤其是結(jié)合脂類的受體可能發(fā)生聚集或失活，導(dǎo)致信號弱或smear。煮樣時需采用溫和條件：加完上樣緩沖液后50°C 30分鐘處理，不要加熱至90-100°C。若膜蛋白有多次跨膜情況如GPCR可選擇EK-6020 ProEx G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）提取和穩(wěn)定試劑盒。
2. 本產(chǎn)品長時間低溫存放可能會出現(xiàn)沉淀，可在37oC水浴約10分鐘以充分溶解沉淀。沉淀完全溶解后即可正常使用。
3. 為保證最佳的使用效果，請盡量避免過多的反復(fù)凍融，可分裝后使用。
4. 裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。
